Utilizzando etichette fluorescenti che si accendono e si spengono, gli ingegneri del MIT, Massachusetts Institute of Technology, possono studiare come le molecole in una cellula interagiscono per controllarne il comportamento.
Gli ingegneri del MIT stanno utilizzando un’innovativa tecnologia a base di etichette fluorescenti per studiare come le molecole interagiscono all’interno delle cellule e influenzano il comportamento cellulare.
Grazie a questo metodo, i ricercatori sono in grado di osservare simultaneamente fino a sette molecole diverse, provando così a rispondere a uno dei problemi fondamentali della biologia: come funzionano le cellule e come possono comportarsi durante l’invecchiamento o a seguito di patologie.
L’obiettivo finale è quello di comprendere come un evento possa innescare una cascata di eventi molecolari a valle e condurre a una specifica funzione cellulare. Questa tecnologia potrebbe rappresentare una svolta fondamentale nella ricerca biologica e aprire nuove possibilità di studio nell’ambito della salute e della medicina.
Il nuovo metodo innovativo prevede l’utilizzo di molecole fluorescenti verdi o rosse che si accendono e si spengono a diverse velocità. Attraverso l’osservazione della cellula per diversi secondi, minuti o ore e l’estrazione dei segnali fluorescenti tramite algoritmi computazionali, è possibile monitorare le variazioni della quantità di ogni proteina bersaglio nel tempo.
L’autore dello studio, il professore di ingegneria biologica e scienze cerebrali e cognitive al MIT nonché membro di prestigiosi istituti di ricerca come l‘Howard Hughes Medical Institute, il McGovern Institute for Brain Research e il Koch Institute for Integrative Cancer Research, oltre a essere co-direttore del K. Lisa Yang Center for Bionics, è il Dott. Edward Boyden, professore di Neurotecnologie.
L’articolo è stato redatto dal postdoc del MIT, Yong Qian.
L’impiego di molecole fluorescenti per l’etichettatura delle proteine all’interno delle cellule ha permesso ai ricercatori di approfondire la conoscenza sulle molecole cellulari. L’uso della proteina fluorescente verde (GFP) per l’immaging risale agli anni ’90, ma attualmente esistono diverse proteine fluorescenti, brillanti di differenti colori, utilizzate a fini sperimentali. Il tono utilizzato ha carattere professionale.
Tuttavia, il comune microscopio ottico ha la capacità di distinguere solamente due o tre colori, limitando l’osservazione dell’attività all’interno delle cellule e riducendo le possibilità di analisi da parte ricercatori. Questo può impedire di valutare con precisione la risposta del sistema nervoso durante l’apprendimento o l’evoluzione di una cellula tumorale.
Il professor Boyden, esperto nel settore, ha affermato che sarebbe l’ideale osservare i segnali delle molecole all’interno delle cellule in tempo reale per comprendere come interagiscono tra loro e come avviene il processo di calcolo all’interno delle cellule. Tuttavia, attualmente, ciò risulta impossibile poiché osservare più elementi contemporaneamente non è fattibile.
In questo senso, il laboratorio del professor Boyden ha recentemente sviluppato un sistema chiamato “multiplexing spaziale”, mediante il quale è possibile osservare fino a cinque diverse molecole all’interno della cellula, indirizzando i reporter luminosi su posizioni distinte. Questo metodo consentirebbe ai ricercatori di distinguere i segnali di molecole diverse, anche se fluorescenti dello stesso colore.
Nel nuovo studio, i ricercatori hanno adottato un approccio innovativo: invece di distinguere i segnali in base alla loro posizione fisica, hanno creato segnali fluorescenti che cambiano nel tempo. La tecnica si basa su proteine fluorescenti commutabili che emettono luce a una velocità specifica.
Per questo studio, Boyden e il suo team hanno identificato quattro fluorofori verdi commutabili e hanno ingegnerizzato altri due, che si accendono e si spengono a differenze velocità. Inoltre, hanno individuato due proteine fluorescenti rosse che cambiano a velocità diverse e hanno progettato un ulteriore fluoroforo rosso.
Ciascuno di questi fluorofori commutabili può essere utilizzato per marcare un diverso tipo di molecola all’interno di una cellula vivente, come un enzima, una proteina di segnalazione o una parte del citoscheletro cellulare. Dopo aver osservato la cellula per diversi minuti, ore o addirittura giorni, i ricercatori utilizzano un algoritmo computazionale per identificare il segnale specifico proveniente da ciascun fluoroforo, in modo analogo alla capacità dell’orecchio umano di distinguere diverse frequenze sonore.
“Come in un’orchestra sinfonica, abbiamo strumenti con tonalità acute, come il flauto, e strumenti con tonalità basse, come la tuba. Nel mezzo abbiamo gli strumenti con tonalità medie, come la tromba, che producono suoni diversi e il nostro orecchio li distingue”, spiega Boyden con metafora.
Gli studiosi impiegano la linear unmixing, una metodologia matematica, per l’analisi dei segnali dei fluorofori. Questo approccio consente di estrarre molteplici segnali di fluorofori, similmente alla trasformata di Fourier, utilizzata dall’orecchio umano per isolare le varie frequenze di un brano musicale.
Una volta completata l’analisi, gli studiosi possono visualizzare le posizioni e il tempo in cui ognuna delle molecole marcate con fluorescenza è stata rinvenuta all’interno della cellula, durante tutto il periodo di imaging. L’imaging può essere eseguito tramite un semplice microscopio ottico, senza la necessità di costose attrezzature specializzate.
In questo studio, gli studiosi hanno applicato il loro approccio etichettando sei diversi composti durante il processo di divisione cellulare, all’interno di cellule di mammiferi. Ciò ha permesso di individuare differenti schemi relativi al modo in cui i livelli degli enzimi chiamati chinasi ciclina-dipendenti mutano, mentre la cellula prosegue nel ciclo cellulare.
I ricercatori hanno dimostrato di essere in grado di etichettare con successo altri tipi di chinasi, le quali sono presenti in quasi tutti gli aspetti della segnalazione cellulare, nonché le strutture cellulari e organelli come il citoscheletro e i mitocondri. Utilizzando cellule di mammifero coltivate in una capsula da laboratorio, gli scienziati hanno dimostrato questo processo anche nel cervello delle larve di pesce zebra.
Secondo i ricercatori, questa tecnica potrebbe rivelarsi molto utile per osservare la risposta delle cellule a molteplici tipi di input, inclusi nutrienti, fattori del sistema immunitario, ormoni o neurotrasmettitori e, inoltre, potrebbe essere applicata per studiare come le cellule rispondono ai cambiamenti nell’espressione genica o alle mutazioni genetiche.
Tutti questi fattori svolgono un ruolo importante nei processi biologici come la crescita, l’invecchiamento, il cancro, la neurodegenerazione e la formazione della memoria. Come afferma Boyden, “si può considerare tutti questi fenomeni come una classe generale di problemi biologici, in cui alcuni eventi a breve termine – come mangiare una sostanza nutritiva, imparare qualcosa o contrarre un’infezione – generano un cambiamento a lungo termine”.
Il laboratorio di Boyden non si limita solo a perseguire studi di questo tipo, ma sta anche lavorando per ampliare il repertorio di fluorofori commutabili per analizzare una vasta gamma di segnali all’interno della cellula. Inoltre, l’obiettivo è di adattare il sistema in modo efficace anche per i modelli murini.
La ricerca è stata possibile grazie al finanziamento di diverse realtà quali Alana Fellowship, K. Lisa Yang, John Doerr, Jed McCaleb, James Fickel, Ashar Aziz, il K. Lisa Yang e Hock E. Tan Center for Molecular Therapeutics del MIT, l’Howard Hughes Medical Institute e gli Istituti Nazionali di Sanità.
